(1)将离心管放入预设温度的恒温培养箱中,进行酶切反应。 (2)注意:不要孵育超过酶的星活性出现时间。星活性出现时间请查阅各酶说明书。 5. 停止反应 酶切反应完成后,取出离心管,置于冰上,以停止酶的活性。 6. 酶切产物的检测 (1)通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。 (2)根据电泳结果,分析酶切是否成功。 四...
一、 建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则,即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常,一个50μl的反应体系中,1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶,则可相应缩短反应时间;如果减少酶的用量,对许多酶来说,相...
酶切反应 一、建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1µg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50µl的反应体系中，1µl的酶在1XNEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1µg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，...
浓度过低,也会影响酶活性。6)注意模板用量和反应体积的关系。对酶用量,模板用量,反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。7)酶切反应的各个组分加完后,需要用TIP小心混匀几次,short spin 一下就可以保温了。一般不能使用振荡器混匀。8)反应温度的选择。一般反应都用37度,但是Sma I的最适合温度是25度,...
三、酶切反应实验步骤 1. 反应体系配制 （1）在离心管中加入1μg经过纯化的DNA模板。（2）根据所选限制性内切酶的推荐比例，加入适量的酶。例如，如果使用1 U限制性内切酶可以完全酶切1μg DNA，那么在本实验中，我们需要加入1 U的酶。（3）向离心管中加入1×CutOneTM Buffer，使总体积达到20 μl。（4）...
酶切反应介绍 一、 建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则,即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常,一个50μl的反应体系中,1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶,则可相应缩短反应时间;如果减少酶的用量,对...
一、酶切不完全的常见原因 1. 酶活性问题：快切酶 - 存储条件不当，如温度过高或过低，会导致酶活性...
在不需要BSA即可达到最佳活性的酶切反应中如果加入BSA也不会影响酶切效果。 反应总体积 建议在50μl反应体系中消化1μg底物DNA。 为避免星号活性,甘油浓度应<5%。 加入内切酶(贮存于50%甘油中)的量应不超过总体积的10%。 使用以下技术,内切酶的反应条件可能未达到最佳反应条件:克隆、基因分型、突变检测、基因定位...
酶切反应建议 一、 建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则,即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常,一个50μl的反应体系中,1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶,则可相应缩短反应...
（四）酶切反应温度 不同的限制性内切核酸酶具有不同的最适反应温度。大多数限制性内切核酸酶的最适反应温度为37℃，但也有例外。酶切反应时低于或高于最适温度，都会影响酶的活性，甚至使酶失活。（五）DNA分子构型 底物DNA分子的构型会对限制性内切核酸酶的活性产生明显影响。超螺旋质粒DNA或病毒DNA分子酶切...