干货｜NCBI 引物设计 Primer-BLAST是NCBI中提供的引物设计工具，将BLAST与全局对准算法相结合，可以一步到位地设计特异性引物，并且可以验证已知引物的特异性，是科研人赖以生存的好伙伴。1.打开NCBI官网，选择BLAST 2.选择Primer-BLAST 3.Primer-BLAST 的输入 进入页面后，具体分为4个部分，分别为PCR Template、Primer...
(八)引物3‘端不可修饰 引物的延伸是从3‘端开始的,不能进行任何修饰。3‘端也不能有形成任何二级结构的可能,除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中,引物3’端不能发生错配。 (九)引物3‘端要避开密码子的第3位 在扩增编码区域,引物3‘端不要终止于密码子的第3位,因为密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特...
检查引物的特异性 步骤1:使用NCBI的BLAST工具 打开浏览器,进入NCBI BLAST网站(https://http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 在BLAST主页上,选择“Primer-BLAST”工具,这是一个专门用于检测引物特异性的工具。 步骤2:输入引物序列 在Primer-BLAST的页面中,分别将你设计的正向引物和反向引物序列粘贴到对应的...
蓝色方框圈出来为“CDS”。 2、PrimerPremier6设计引物 打开PrimerPremier6,菜单栏File→New→Sequence, 或使用快捷键:Ctrl + E输入CDS序列,然后点击Add(添加)。 参数设置:Analyze→Primer Search, 或使用快捷键:Ctrl + M 点击“引物参数”,设置熔解温度,设置引物长度,设置扩增产物长度。 可替换引物对,默认是5对。
一、引物设计原则引物 引物与扩增效率、产物特异性十分相关,因此引物设计的一般原则为: 表1 二、选择和设计荧光定量PCR的引物 1、从文献中直接查找,经过BLAST验证引物特异性后直接使用: (1)如何在文献中查找引物: ①打开pubMed或百度学术输入所查基因名称,翻看相关文献 ,选定文章内的引物(Forward/Reserve)打开NCBI;...
一、引物设计的基本原则 1. 用于PCR反应的引物需要两条,分别设在被扩增目的的片段的两端,并分别与模板正负链序列互补,避免出现二聚体、发夹结构等 2. 引物的长度一般以18-25个核苷酸为宜,特殊情况下可适当增加,引物过长容易产生寡核苷酸的链内互补,形成发卡状结构,影响引物与模板之间的互补; ...
一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因,找到该基因的mRNA,在CDS选项中,找到编码区所在位置,在下面的origin中,Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5,点击File-New-DNA sequence,出现输入序列窗口,Copy目的序列在输入框内(选择As),此窗口内...
1、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2、引物长度一般在15-30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，...
之后就可以在在Gene Bank 查找目标基因的目标序列进行引物设计了。 注意:软件激活完之后不会自动创建快捷方式,需要在安装包内将软件创建快捷方式到桌面。 另外安装包可以放在电脑的任意磁盘,记住,不要删掉安装包! 3、Primer Premier 5搭配Oligo 6设计引物
引物长度一般在18~30 nt之间，扩增产物长度尽量控制在 100~300 bp之间。引物设计太短会导致非特异扩增，太长则容易形成二级结构(如发夹结构)。扩增产物太长不适于聚合酶进行反应，会影响到PCR扩增效率。3. GC含量和Tm值 引物GC含量控制在40%~60%之间，过高或过低都不利于引发反应。正反向引物GC含量应接近相同，...