实验教学—酵母双杂交系统 步骤: 1、酵母菌株的保存与表达型验证 在30C°培养,直到菌落直径达到2mm,约需3-5天,密封平板,4°C保存。2)正常的Y190菌落由于ade2-101突变而呈粉红色,并且直径>2mm。挑取3-4个菌落置于不同培养平板上(SD/-Trp,SD/-Leu,,SD/-His,SD/-Ura,YPD),培养4-6天。核对其不同的生...
双杂交和其他双成分系统实验(1)|双杂交|双成分系统 实验材料 载体和酵母菌 试剂、试剂盒 缓冲液和溶液 SDS 凝胶上样缓冲液
(Yeast two hybrid,Y2H) 常用于分析两种蛋白质的相互作用。将两种蛋白质分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子的DNA结合结构域(DNA-BD)和转录激活域(AD)上,构建成融合表达载体,从而分析两种蛋白质的相互作用。 pGBKT7是酵母双杂交bait表达载体,旨在表达GAL4 DNA结合结构域(DNA-BD,1-147 aa)与bait蛋白质的融合蛋...
1989年,Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立[1]。 酵母双杂交技术最初由Fields等人在研究酵母转录因子GAL4性质时建立,后续经过不断改进已发展成为一种成熟的protein-protein互作研究技术,被广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白互作的鉴定和验证、蛋白互作机理的探究、蛋白连锁图谱绘制等工作。 Yeast two-hybrid system的...
酵母双杂交实验是一种研究蛋白质相互作用的高效方法。实验基于酵母转录因子GAL4的特性，利用其DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）的结合来激活特定基因的转录。AD与X蛋白融合，BD与Y蛋白融合。若X、Y蛋白能形成复合物，AD与BD空间接近，激活GAL4转录因子，启动报告基因转录。实验流程分为四个主要...
一、酵母双杂交 1. 阳性克隆的筛选 (1)随机选取50个阳性克隆,扩增、抽提酵母质粒,电转化E.coliKC8宿主菌,抽提大肠杆菌中的质粒,酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。 (2)如果重复的插入序列较多,可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列,再转化新的宿主细胞,检测是否仍为阳性...
酵母双杂交系统可进行两个蛋白互作分析,可用一个已知的蛋白因子(在双杂交系统中称为诱饵蛋白)去钓取与其结合的蛋白;也可用进一步验证两个蛋白之间的互作。 酵母双杂交实验细节(酵母双杂交技术步骤) 酵母双杂交实验原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现,许多真核生物的转录激活因...
下面是双杂交技术的实验步骤: 1.构建酵母双杂交系统:选择酵母菌株(如Saccharomyces cerevisiae),构建表达载体,将目标基因的编码区域与转录激活因子(如GAL4)的DNA结合,构建双杂交系统。 2.交叉配对:将两个转录激活因子(如GAL4)的相应DNA结合区域与目标融合基因的编码区域分别克隆到不同的表达载体中,转化至酵母细胞中,...
在此项目中酵母双杂交实验最关键的步骤是酵母培养时间的掌控。在吸取5uL转入含50mL YPDA液体培养基的250mL锥形瓶中,30℃120rpm/min振荡培养的步骤中其OD600达到0.15-0.3(16-20h)很重要,这关系到酵母细胞的浓度及生长状态。且下一步把沉淀下来的酵母细胞转入含100mLYPDA液体培养基的250mL锥形瓶中,30℃120rpm/min...
实验原理 细菌双杂交系统是研究在大肠杆菌中蛋白质与蛋白质相互作用的方法。这个系统是建立在转录活化作用基础上的并且包括细菌中两种融合蛋白质的合成,这两种蛋白质的相互作用可以激活一个报告基因的转录。特异地,当与一种融合蛋白相互作用的伙伴与细菌RNA聚合酶的一个亚单位融合时,这种融合蛋白就可以行使一个转录激活...